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丹東百特儀器有限公司
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關鍵詞：靜態(tài)流動模式、BSA蛋白、分子量分布
BeNano靜態(tài)流動模式適用于與凝膠滲透色譜GPC/SEC連接使用，其中GPC設備可以配置一個示差折光檢測器或者一個紫外檢測器，可以依賴于樣品組分的大小將每個組分分離，并依次流出。
BeNano靜態(tài)流動模式在90°使用PD檢測器收集樣品散射光強度信號，并同時收集示差折光檢測器或者紫外檢測器信號，結合這兩個信號計算得到每個流出組分的絕對分子量和分子量分布信息。由于BeNaon采用的是單角度靜態(tài)光散射，根據(jù)瑞利散射理論，只要分子大小不超過波長1/40，結果的準確性都能夠得到保證，這尤其適合蛋白質類樣品的檢測。BeNano對于不同種類樣品的準確檢測上限如下表：
在這個應用中，我們將BeNano主機與SEC前端相連接，檢測了BSA牛血清蛋白樣品的分子量和分子量分布信息。
原理和設備
前端凝膠色譜中使用了市場中某主流品牌SEC，具有RI檢測器，使用TSK氧化硅柱進行分離。
測試采用丹東百特BeNano 180 Zeta Max納米粒度及Zeta電位分析儀，儀器使用波長671 nm、功率50 mW激光器作為光源，在90°進行光散射信號收集。測試使用了27μL 低容量流通池作為檢測池。利用BFC-1信號采集器收集前端SEC設備的示差折光檢測器輸出的模擬信號。
樣品制備和測試條件
將BSA分散在pH=7的PBS緩沖液中，配置濃度為5mg/mL。進樣量100 μL，流速為0.7mL/min。
通過前端SEC進行進樣，分離。分離后的樣品組分逐一進入RI檢測器和BeNano進行信號收集。BeNano溫度控制在25℃，基本與室溫一致。
測試結果和討論
圖1. BSA牛血清蛋白色譜流出曲線（上圖）和分子量流出曲線（下圖）
圖1可以看出，BSA樣品經(jīng)過色譜柱分離得到若干個流出峰，說明BSA在PBS中形成一系列團聚狀態(tài)。對于RI和光散射信號進行基線設定和積分線設定，得到每一個峰對應的分子量，得到的分子量列于表1中。
圖2為對于整體信號積分得到的整體分子量流出曲線。通過分子量隨流出體積曲線可以看出，分子量隨著流出體積逐漸降低，這符合凝膠色譜的分離原理。在每一個峰內，分子量均形成平臺，這符合蛋白質每個峰內某種寡聚狀態(tài)的分子量都分布極窄的特征。
表1. BSA峰內分子量Mw結果
通過表1每個峰的分子量可以看出，峰1（最后的流出峰）的分子量為66K，這與BSA的理論分子量一致，峰2-4的分子量均為峰1的倍數(shù)，說明峰2-4分別為二聚體、三聚體和四聚體。
結論
在該應用報告中，利用BeNano靜態(tài)流動模式檢測了BSA樣品的分子量信息。通過結果可以看出，BeNano靜態(tài)流動模式可以分別準確地得到一系列BSA樣品流出峰的分子量，通過分子量值可以準確判斷出各個流出峰對應的團聚狀態(tài)。
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