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利用BUCHI SFC系統

加速尿嘧啶和黃嘌呤類化合物的制備分離

尿嘧啶和黃嘌呤類物質，即咖啡因、可可堿和茶堿，是一類在各種人類生物活動過程中發揮重要作用的有機化合物。這些分子屬于雜環化合物類，其特點是含有既有碳又有氮原子的環結構。尿嘧啶是 RNA 的基本組成部分，是構成遺傳密碼并參與蛋白質合成的核堿基之一。

另一方面，咖啡因、可可堿和茶堿這些黃嘌呤類物質，是結構相似但具有不同生物效應的生物堿。這些黃嘌呤類物質存在于各種植物來源中，是眾所周知的刺激物質，能夠穿過血腦屏障并影響中樞神經系統，目前成熟且廣泛應用的分離方法往往是利用 RP-HPLC（反向色譜法）。

▲ 圖示：利用 YWG C18（150 x 4.6mm，5μm）色譜柱，7.5% 甲醇等度，10mmol/L KH2PO4-Na2HPO4 緩沖液（pH 5.0）分離混合物，紫外檢測波長 260nm。1.尿嘧啶；2.胸腺嘧啶；3.腺嘌呤；4.可可堿；5.尿嘧啶丙酸；6.茶堿；7.咖啡因[1]

關于此類應用的反向色譜法已經被優化到了極致，因此在本文中，我們想嘗試以不同的方式來分離這些化合物，找出一個更快、更高效的解決方案。

SFC（超臨界流體色譜）是一種色譜技術，其移動相的一個重要組成部分是超臨界二氧化碳。二氧化碳處于超臨界狀態時具有獨特的性質，如高擴散系數和低粘度，使其成為化合物分離和分析的優良溶劑。SFC 相對于傳統色譜方法具有許多優勢，包括更快的分析時間、更低的溶劑消耗以及在分離中的差異選擇性。此外，與 RP-HPLC 相比，SFC 代表了一種正交技術，為各種分析挑戰提供了互補的分離能力。

在 SFC 中，篩選色譜柱并找到最適合特定分離任務的固定相，是提高分離度的關鍵步驟。固定相是色譜系統的重要組成部分，因為它直接影響選擇性。不同的固定相具有不同的化學功能和與樣品相互作用的能力，使其對特定化合物更具選擇性。通過篩選和選擇合適的色譜柱，可以優化分離條件，實現目標分析物的更好分辨率和靈敏度。

本文描述了使用 Sepmatix 8x SFC 平行色譜分析系統對尿嘧啶、咖啡因、可可堿和茶堿混合物進行平行柱篩選，并隨后將方法放大到制備型 Sepiatec SFC-50 儀器的過程。

設備

▲ Sepmatix 8x SFC 超高效平行色譜系統

▲ Sepiatec SFC-50 制備色譜系統

色譜柱

• BUCHI PrepPure 硅膠, 5 um, 250 x 10 mm制備色譜柱

• BUCHI PrepPure 二醇基, 5 um, 250 x 10 mm制備色譜柱

• BUCHI PrepPure PEI, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure CBD, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure 硅膠, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure 二醇基, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure 氨基, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure 2-EP, 5 um, 250 x 4.6 mm

• Reprosil 4-EP, 5 um, 250 x 4.6 mm (Dr. Maisch GmbH)

• 氰基, 5 um, 250 x 4.6 mm, (Dr. Maisch GmbH)

1 試劑與樣品

• 食品級二氧化碳（99.9％）

• 甲醇（≥ 99％）

• 尿嘧啶（99+％）

• 可可堿（99％）

• 咖啡因（99+％）

• 茶堿（99％）

樣品準備：在 50/2.5mL 甲醇/水中，溶入50mg 尿嘧啶，70mg 咖啡因，55mg 可可堿和85mg 茶堿，需加熱至 40℃，并配合超聲波輔助溶解。

2 實驗部分

1、利用 Sepmatix 8x SFC 篩選色譜柱

篩選結果：

使用 Sepmatix 8x SFC 平行色譜儀器可以高效地同時篩選 8 根柱。因此，可以在很短的時間內確定最佳選擇性。為此，使用了8種不同的固定相：硅膠、氨基、氰基、二醇基、2-EP、4-EP、PEI 和 CBD（型號請見上文），具體表現請看下圖。

▲ 圖示：8根不同固定相的色譜柱在分離尿嘧啶，咖啡因，可可堿和茶堿混合物時的表現。

結果顯示除了氰基、2-EP 和 4-EP 相外，所有其他固定相都可以分離樣品，因此我們需要分析最佳分離度的固定相。此時，分辨率（R）可以量化分析物之間的分離程度。

在處理復雜混合物時，R 值尤為重要，因為它確保每種分析物都能被很好地分離并準確識別和定量。R 為 1 表示峰根本沒有分離，實質上是合并的，而更高的R值表示峰之間的分離更好。在實踐中，R 至少為 1.5 通常被認為是適合進行正確定量和鑒定分析物的。

• tR2 和 tR1 =組分 1 或組分 2 的保留時間

• W1 和W2 =組分 1 或組分 2 的峰高的一半處的寬度

我們將不同固定相的R值計算并列入下表進行對比：

篩選和 R 值的評估顯示，硅膠、二醇基和 PEI 相具有最佳的選擇性來分離樣品，我們需要結合分離圖譜來篩選合適的固定相。在硅膠柱上，第一個與第二個峰并未呈現完全的基線分離。使用 PEI 相時，由于樣品分子的較高滯留性，運行時間相對較長。而二醇基無論在分離度和時間上都有出色的表現，因此我們最終選擇二醇基作為制備分離時的固定相，色譜柱為 BUCHI PrepPure  二醇基, 5 um, 250 x 10 mm 制備色譜柱。

2、使用 Sepiatec SFC-50 制備分離樣品

在 SFC 上，我們可以通過堆疊進樣的形式來制備純化，其生產率明顯高于通過多次進樣進行的梯度純化。由于堆疊進樣只能在等度條件下進行，因此需要先摸索不同等度比例下樣品分離效果。

實驗結果：

▲ 圖示：33% 等度甲醇，4min 條件下，尿嘧啶，咖啡因，可可堿和茶堿混合物的分離效果

▲ 圖示：12% 等度甲醇，5min 條件下，尿嘧啶，咖啡因，可可堿和茶堿混合物的分離效果

由上圖可得知，33% 的甲醇條件下，尿嘧啶，咖啡因，可可堿和茶堿無法被完全分離，而 12% 的甲醇條件下，樣品分離度非常好。以此為基礎，我們進一步去開發疊層進樣的方法。

通過 Sepiatec SFC 的智能疊層進樣時間推薦，我們把疊層進樣的時間設置為 2.42 分鐘，既每 2.42 分鐘一次注入一次樣品，總計 8 次，上樣量增加到 0.12mL。

▲ 圖示：通過 2.42min 間隔的疊層進樣在短時間內進行8次制備分離

▲ 圖示：多次進樣的疊加圖片

每次進樣的相應疊加 UV 信號表明該方法具有良好的重現性，垂直線描述了收集相應份數的時間窗口。

硅膠色譜柱的分離：

為了與二醇基填料進行對比，我們也嘗試使用硅膠填料進行疊層進樣與分離，其參數如下：

實驗結果：

▲ 圖示：通過 2.15 min 間隔的疊層進樣在短時間內進行 7 次制備分離

▲ 圖示：多次進樣的疊加圖片

與二醇基相比，硅膠在 100bar 下表現更好，時間也更短。但是，在 R=1.57 的分辨率下，第一與第二個峰并不能理想地基線分離，會造成部分樣品損失。

2 結論

3 參考

1.韓金土, 樂良. 生物堿基及其衍生物的反相離子對色譜行為研究. 信陽師范學院學報（自然科學版）第12卷，第2期，1999年4月