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關(guān)鍵詞：蛋白、微流變、粘彈性信息、溫度變性

動態(tài)光散射微流變是通過動態(tài)光散射得到示蹤粒子的均方位移MSD來得到溶液流變學(xué)信息的技術(shù)，可以用來檢測中低粘度高分子溶液體系、蛋白溶液、凝膠體系，在這種體系中示蹤粒子可以具有明顯位移。相對于機(jī)械流變技術(shù)，微流變的檢測過程和數(shù)據(jù)處理直接快速，可以得到高頻下樣品的粘彈性信息。

BSA蛋白加熱變性示意圖

在這個應(yīng)用報告中，使用丹東百特公司出品的BeNano 180 Zeta 納米粒度及 Zeta電位分析儀檢測了不同BSA樣品。BSA溶液在低溫條件下分散較好，在加熱過程中會發(fā)生熱變性，生成蛋白質(zhì)團(tuán)聚物，從而極大的改變?nèi)芤盒再|(zhì)。我們通過BeNano微流變技術(shù)檢測了BSA溶液不同溫度下的粘彈性信息。

原理

動態(tài)光散射微流變中加入粒徑范圍在0.3-2.0μm的膠體顆粒作為示蹤粒子。這些示蹤粒子的運(yùn)動方式反映了周圍環(huán)境的流變學(xué)性質(zhì)。對于純粘性流體樣品（牛頓流體），示蹤粒子在整個樣品環(huán)境中自由擴(kuò)散，顆粒的均方位移MSD隨時間線性增加。

其中D為顆粒的擴(kuò)散系數(shù)，通過帶入標(biāo)準(zhǔn)Stokes-Einstein方程：

其中R(h)是示蹤粒子的半徑，便可以得到MSD與粘度之間的關(guān)系：

通過擬合MSD隨時間的曲線，即可得到牛頓流體的粘度𝜂。然而在一些體系中還包含彈性成分，對于此類體系，我們用廣義Stokes-Einstein方程進(jìn)行描述：

這個方程可以通過MSD計(jì)算依賴于頻率的彈性/存儲模量G’和粘性/損耗模量G”， 并可以計(jì)算復(fù)數(shù)粘度以及蠕變?nèi)崃俊?/p>

設(shè)備

采用丹東百特公司的BeNano 180 Zeta 納米粒度及 Zeta電位分析儀。儀器使用波長671 nm，功率50 mW激光器作為光源，設(shè)置在173°的APD檢測器進(jìn)行散射光信號采集。采用單模光纖進(jìn)行信號傳導(dǎo)，以最大程度的提高信噪比。

樣品制備和測試條件

>粒徑和散射光強(qiáng)溫度掃描

配置了10mg/mL BSA溶液，通過BeNano內(nèi)置的溫度控制系統(tǒng)將測試溫度控制為40℃ - 70℃，以1℃為升溫間隔，每一步溫度改變至少進(jìn)行60秒的溫度平衡。

>微流變溫度掃描

在BSA溶液中加入400 nm帶負(fù)電的聚苯乙烯球作為示蹤粒子，在25℃-70℃之間以一定溫度間隔檢測BSA溶液的流變學(xué)信息。

測試結(jié)果和討論

首先分別測試了BSA溶液和示蹤粒子懸浮液的Zeta電位，BSA溶液Zeta電位為-14.35mV，400nm示蹤粒子Zeta電位為-51mV。BSA和示蹤粒子都攜帶負(fù)電性，這可以避免正負(fù)電荷相互作用引發(fā)的團(tuán)聚等不穩(wěn)定因素。

通過樣品的原始散射光信號，我們得到這些樣品的相關(guān)曲線：

圖1. 不同溫度下BSA（含示蹤粒子）溶液的相關(guān)曲線

圖2. 不同溫度下BSA溶液的MSD曲線

圖3. 不同溫度下BSA溶液的粘彈性模量曲線

圖4. 不同溫度下BSA溶液的復(fù)數(shù)粘度曲線

圖5. BSA的粒徑與散射光強(qiáng)（上圖）和@2096 rad/s的復(fù)數(shù)粘度（下圖）隨溫度變化曲線

通過圖1-圖5可以看出，在25℃-60℃之間，隨著溫度的升高，相關(guān)曲線的衰減變快，這表明了示蹤粒子的運(yùn)動速度隨溫度升高而加快，這是由于溶液的粘度隨著溫度上升而下降引起的，同時這個溫度區(qū)間內(nèi)溶液的粘彈性模量均隨溫度升高而降低。同樣通過MSD曲線可以看出，在同樣的溫度范圍內(nèi)，溫度越高，MSD值越大示蹤粒子速度越快。

而在60℃-70℃之間隨著溫度的升高，相關(guān)曲線的衰減變慢，這表明了示蹤粒子的運(yùn)動速度隨溫度升高而降低，這是由于BSA在這個溫度范圍內(nèi)熱變性生成了大分子團(tuán)聚物，團(tuán)聚物的產(chǎn)生急劇增加了樣品粘度和粘彈性。

對比圖5中BSA粒徑與光強(qiáng)對于溫度的依賴性，可以看通過微流變得到的復(fù)數(shù)粘度同樣在~65攝氏度左右急劇升高。粒徑和復(fù)數(shù)粘度對于溫度的依賴性相互對應(yīng)。

結(jié)論

通過檢測結(jié)果，我們可以看到BeNano 對于一個蛋白質(zhì)樣品的微觀流變學(xué)檢測能力。在一個溫度范圍內(nèi)的BSA的微流變信息靈敏且準(zhǔn)確的反映了蛋白溶液的溫度轉(zhuǎn)變過程。通過微流變測試，在一個短時間測試過程中可以得到樣品較高頻率下的流變學(xué)參數(shù)，包括均方位移、復(fù)數(shù)粘度、粘彈性模量、蠕變?nèi)崃康鹊龋瑸楸碚饕后w的流變學(xué)特性提供了有利工具。